PROPUESTA DE METODOLOGÍA PARA LA CERTIFICACIÓN DE PLANTA DE QUERCUS ILEX INOCULADA CON TUBER MELANOSPORUM PARA APLICACIÓN COMERCIAL.

FISCHER, Christine (1) y COLINAS, Carlos (1)

Dep. de Investigación Forestal de Valonsadero, Apdo. 175, E-42080 Soria, España

(1) Dirección actual: Universitat de Lleida. Dept. de Producció Vegetal i Ciència Forestal. Av. Alcalde Rovira Roure, 177. E-25198 LLEIDA. España.

Comunicación presentada en la Reunión de Coordinación de INIA sobre Truficultura, celebrada en el Centro de Investigación Agraria de la Diputación General de Aragón en Zaragoza el 12 de Junio de 1997.

INTRODUCCIÓN

La disminución de la producción de trufa comestible (Tuber sp) durante los últimos 50 años en lugares de producción natural en Francia, Italia y España, ha motivado un gran interés en su cultivo. Los métodos de inoculación comerciales han sido utilizados en Francia y en Italia desde los años setenta, con certificación de la calidad de planta y de la micorrización por parte de los organismos competentes de los distintos países (Chevalier y Grente 1978; Bencivenga y col. 1987) que ha sido renovada recientemente en Italia (Bencivenga y col. 1995). En los pasados cinco años el interés por la truficultura se ha incrementado en las regiones calcáreas de España, siendo necesario un método práctico y económico para la certificación de planta inoculada producida comercialmente en los viveros Españoles.

OBJETIVOS

Los objetivos de nuestro estudio son:

1) Determinar el número mínimo de ápices de raíz que es necesario observar en una planta para obtener un valor representativo de la proporción de ápices radiculares inoculados con Tuber (PT) y la proporción de contaminantes (PC) existente en su raíz.

2) Determinar el número mínimo de plantas que es necesario observar en un lote para obtener un valor representativo de la proporción de ápices radiculares inoculados con Tuber (PT) y la proporción de contaminantes (PC) existente en las raíces de las plantas del lote.

3) Desarrollar unas directrices para certificar o rechazar un lote de plantas en función de su calidad y de sus niveles de ectomicorrización por Tuber melanosporum y por contaminantes.

Aquí se presenta el método desarrollado en este estudio.

METODO

Identificación del lote

La certificación comienza con la documentación de homogeneidad y garantía fitosanitaria establecida por los estándares nacionales. La homogeneidad de planta de un lote requiere que todas las plantas presenten en común las siguientes condiciones: Procedencia de la semilla, fuente y método de inoculación, fecha de inoculación, sustrato y condiciones del vivero.

Toma de muestras

De cada lote seleccionamos 12 plantas. Éste número está basado en la variabilidad entre lotes (Fischer y Colinas, 1996). Es esencial que esta sección sea desarrollada por el agente de control y que sea totalmente aleatoria para evitar cualquier tipo de desviación y satisfacer los requerimientos de los métodos estadísticos utilizados. Las plantas deben ser transportadas al laboratorio de certificación refrigeradas y almacenarse a 4ºC hasta que sean examinadas, preferiblemente en un plazo de 2 semanas desde la toma de muestras en vivero.

Procedimiento de lavado

Las plantas deben de ser cuidadosamente extraídas del contenedor con el cepellón completo y sumergidas en un baño de agua para empapar el sustrato. Después, se procederá a eliminar el sustrato de las raíces de las plantas, una por una, en una bandeja de agua con agitaciones suaves para no romper los ápices cambiando el agua frecuentemente y sin aplicar la presión directa de un chorro de agua. Los restos de sustrato que quedan adheridos a las raíces se pueden eliminar con pinzas finas bajo el microscopio estereoscópico

Evaluación de calidad de planta

Antes de la evaluar de los niveles de micorrización es necesario verificar que las plantas cumplen los criterios de calidad (Apéndice 1). Las plantas que no cumplen estos niveles estándar de calidad no serán evaluadas en el meticuloso proceso de conteo de ápices. Los estándares de la Unión Europea establecen que al menos un 95% de plantas de un lote superen los controles de calidad de planta (Peñuelas 1993). El analista documentará los resultados de su evaluación en la Hoja de Datos de Planta (Apéndice 2)

Primera observación al microscopio estereoscópico

El segundo paso en el examen es una primera observación de todo el sistema radical de la planta al microscopio estereoscópico, observando la abundancia de raíces tróficas, el estado micorrícico, la presencia, desarrollo y apariencia general de las micorrizas de T. melanosporum, y la presencia de contaminantes . En esta etapa el analista tiene que examinar al microscopio óptico los ápices cuyo estado micorrícico sea incierto para facilitar el conteo posterior. Si se encuentran ápices micorrizados con una especie de Tuber distinta de T. melanosporum el lote deberá ser rechazado.

En esta fase se han de cumplir otros tres criterios: a) un mínimo de 250 raíces tróficas; b) porcentaje de micorrización con T. melanosporum no claramente inferior al 10%; c) porcentaje de micorrizas contaminantes no claramente superior al 50%. El analista documentara los resultados de esta evaluación en la Hoja de Datos de Planta (Apéndice 2).

Conteo de ápices

En las plantas que hayan superado las dos primeras evaluaciones se medirán las proporciones de T. melanosporum (PT) y de contaminantes (PC). El procedimiento es el siguiente:

1) Eliminar el tallo y cortar el sistema radicular de la planta en dos o en cuatro partes iguales en sentido longitudinal, eligiendo aleatoriamente una parte para su análisis.

2) Cortar cuidadosamente el sistema radical en segmentos de 2-3 cm y situarlos sobre una cuadrícula de 1 cm x 1 cm en una bandeja de análisis con agua.

3) Distribuir los segmentos homogéneamente por toda la superficie de la bandeja evitando romper ápices y comenzar el conteo utilizando cuadriculas elegidas aleatoriamente.

4) En cada cuadrícula elegida se clasificarán todas las raíces tróficas en las siguientes categorías: No micorrizadas (N), micorrizadas con T. melanosporum (T), micorrizadas con micorrizas contaminantes (C). Los ápices senescentes se considerarán no micorrizados.

5) Continuar el conteo hasta haber observado 250 ápices (Fischer y Colinas, 1996).

El analista documentara los resultados de esta evaluación el la Hoja de Datos de Planta (Apéndice 2).

Determinación de las proporciones de cada planta

Después de haber examinado 250 ápices se calcularán las siguientes proporciones:

- Proporción de T. melanosporum (PT) = T/(N+C)

- Proporción de Contaminantes (PC) = C/T

El analista debe introducir los datos de la planta en la Hoja de Datos de Planta (Apéndice 2).

Determinación de intervalos de confianza de PT y de PC de un lote (Apéndice 3)

Después de hacer los cálculos de PT y PC para las primeras 5 plantas, el analista determinará los intervalos de confianza al 95% para los valores de PT y PC de el lote. Si los criterios son cumplidos, el lote puede ser certificado sin continuar el muestreo. Si no es así, el analista debe de continuar el muestreo hasta que se cumpla el criterio de aceptación o se alcance la decimosegunda planta. Si el lote no cumple los criterios, no podrá ser certificado.

Criterio de certificación

El lote será admitido cuando se cumplan los siguientes criterios:

a) No debe haber ninguna planta que no haya cumplido los criterios de calidad.

b) No debe haber ninguna planta que no haya cumplido los criterios de la primera observación.

c) No debe haber ninguna planta que tenga una PT menor de 0.11 (10%).

d) No debe haber ninguna planta que tenga una PC mayor de 1.0 (50%).

e) El limite inferior del intervalo de confianza de PT debe ser mayor de 0.50 (33% colonizado por T. melanosporum).

f) El limite superior del intervalo de confianza de PC debe ser menor de 0.33 (el nivel de contaminantes en raíces tróficas debe ser inferior al 25%)

g) No debe haber ninguna planta con micorrizas de una especie de Tuber distinta de T. melanosporum.

Si un lote no cumple los criterios e, f, y g, el lote no podrá ser admitido.

Si un lote cumple los criterios de e, f, y g, pero 1 ó 2 plantas no cumplen los criterios a, b, c, o d, el lote puede someterse a una segunda evaluación con una muestra mayor.

Si un lote cumple los criterios de e, f, y g, pero 3 o más plantas no cumplen los criterios a, b, c, o d, el lote no podrá ser admitido.

Segunda evaluación de calidad de planta

Cuando encontramos una planta inadmisible en una muestra de tan solo 12 plantas, no podemos garantizar que el lote tenga menos del 5% de plantas en esas condiciones. Por ello necesitamos una muestra de 90 plantas (Steel y Torrie 1980). Esta segunda evaluación sólo deberá abordarse si PT y PC estimados a partir de la primera muestra son lo suficientemente buenos como para pensar que el lote podría ser admitido.

El proceso para la segunda evaluación es similar al primero en el sentido de que cada planta tiene que cumplir los criterios de calidad de planta y la primera observación al microscopio estereoscópico. No es necesario el conteo de ápices de raíz si las plantas cumplen estas dos etapas.

El intervalo de confianza dependerá del numero de plantas analizadas y del número de plantas rechazadas hasta el momento y se puede hallar en las tablas de intervalos de confianza binomiales con un límite superior del 5% de las plantas rechazadas (Steel y Torrie 1980). El analista podría obtener intervalos de confianza cada 5 ó 10 plantas después de la planta número 23, que es la primera en que la amplitud del intervalo de confianza puede ser menor que el límite. De esta manera será posible aceptar o rechazar un lote sin necesidad de evaluar la muestra de 90 plantas por completo.

DISCUSIÓN

La certificación de lotes de planta colonizados por micorrizas de Tuber es un proceso destructivo y laborioso, por lo que es importante muestrear el mínimo número de plantas necesario para satisfacer los requerimientos estadísticos que establecen si se cumple el criterio.

Las dos primeras fases de este método permiten a un analista bien formado rechazar rápida y sistemáticamente plantas y lotes que obviamente no cumplirán los criterios establecidos, y reduce el tiempo necesario del proceso de conteo de ápices.

Si las plantas en un lote dado aparecen homogéneas y tienen buena colonización de trufa y escasos contaminantes, el analista puede comenzar a calcular los intervalos de confianza del lote a partir de la quinta planta en lugar de completar las 12. En lotes buenos son suficientes cinco plantas para tener la certeza de que se cumplen los criterios de certificación con la consiguiente reducción de costes para el viverista.

Para un lote de 1000 plantas, el coste de certificación no supera el 3% del precio de mercado de la planta micorrizada con trufa. Estos costes se reducirán a medida que este método se perfeccione con el uso.

Los niveles umbral que hemos elegido para PT y PC están basados en nuestras observaciones de plantas inoculadas en vivero y en los estándares italianos (Bencivenga pers. com.). Nosotros hemos seleccionado un PT de 0’50 o 33% de ápices de raíz inoculados por Tuber melanosporum . El PC de 0’33 establece el límite de contaminantes inferior al 20% de la cantidad de micorrizas de Tuber melanosporum, y por tanto limita el nivel de contaminantes al 25% de los ápices de raíz colonizados.

Sería necesario evaluar estos resultados en campo para justificar estos niveles bajo diferentes condiciones ambientales. Idealmente un programa de certificación debe incluir un programa de investigación para identificar contaminantes que constituyan una amenaza al desplazar la ectomicorriza deseada (Bencivenga, M. y col. 1995)

BIBLIOGRAFÍA

Bencivenga, M., Di Massimo, G., Donnini, D. y Tanfulli, M. 1995. Micorrize inquinanti frequenti nelle piante tartufigene: Nota 1-Inquinanti in vivaio. Mic. Ital. 2: 167-178.

Bencivenga, M., Donnini, D., Tanfulli, M., y Guiducci, M. 1995. Tecnica di campionamento delle radici e degli radicali per valutazione delle piante micorrizate. Mic. Ital., 2: 35-47.

Bencivenga, M., Ferrara, A.M., Fontana, A., Granetti, B., Gregorio, G., Lo Bue, G., Palenzona, M., Rebaudengo, E., Tocci, A. y Zambonelli, A. 1987. Valutazione dello stato di micorrizacione in piantine tartufigene. Ministero dell'Agricoltura e delle Foreste, Italia, 1987.

Chevalier, G. y Grente, J. 1978. Application practique de la symbiose ectomycorrhizienne: production à grande échelle de plants mycorrhizés par la truffe (Tuber melanosporum Vitt.). Mushroom Science, 10: 483-505.

Danielson, R.M. 1984. Ectomycorrhiza formation by the operculate discomycete Sphaerosporella brunnea (Pezizales). Mycologia 76 (3): 456-461.

Fischer,C. y Colinas,C. 1996. Puesta a punto de un método de control de planta de Quercus ilex inoculada con Tuber melanosporum. Informe final. Centro de Investigación Forestal de Valonsadero. Junta de Castilla y León. Soria.

Peñuelas Rubira, J. 1993a. El cultivo de la planta forestal en España. Montes, 31: 55-60.

Peñuelas Rubira, J. 1993b. Calidad de la planta forestal para el plan de reforestación de tierras agricolas. Montes, 33: 84-97.

Peñuelas Rubira, J. 1995. Calidad de la planta forestal: normativa y control. Ponencia presentada en las Jornadas sobre nuevas tecnicas de producción de planta forestal. Junta de Castilla y León, Consejería de Medio Ambiente y Ordenación del Territorio, Dirección General del Medio Rural. Molinos de Duero, Soria. 7-10 Octubre de 1995.

Steel, R. y J. Torrie. 1980. Principles and Procedures of Statistics. McGraw-Hill Publishing Company. New York, NY, EE.UU.

Zambonelli, A. y G. Govi. 1991. Competizione fra Tuber albidum ed altri funghi: 3º contributo. Mic. Ital. 3: 15-12.

Apéndice 1: Criterio de evaluación de calidad de planta para Quercus ilex en contenedor

Apéndice 2: Hoja de Datos de Planta

Apéndice 3: Determinación de intervalos de confianza de PT y de PC de un lote

Apéndice 4: Estimación de costes de control de una planta de Quercus ilex micorrizada con Tuber melanosporum